RNA干扰体外抑制HepG-2细胞bcl-2的表达

张小丽[1、2] 朱道银[1] 唐恩洁[3]*

1.重庆医科大学免疫微生物教研室重庆市渝中区医学院路1号，400016；2.川北医学院寄生虫教研室四川省南充市涪江路234号，637007；3.川北医学院免疫与分子生物学研究所四川省南充市涪江路234号，637007

［摘要］目的：探索靶向bcl-2基因的shRNA表达载体抑制高表达的 bcl-2蛋白，诱导HepG-2细胞凋亡、抑制其生长的作用。方法：采用DNA重组、DNA序列测定、RT-PCR、细胞凋亡与增殖检测等技术初步观察了shRNA表达载体抑制bcl-2基因转录与翻译；诱导高表达bcl-2基因的HepG-2细胞凋亡及增殖受抑作用。结果：分析比较证实成功构建的3个靶向bcl-2的shRNA表达载体之一，即pGenesil-B2可有效抑制bcl-2表达（mRNA转录抑制率为49.1%）、并致细胞凋亡（细胞凋亡率为65.1%）和增殖抑制（抑制率为46.4%）。这些研究结果表明能有效抑制肿瘤细胞高表达的bcl-2基因的RNA干扰技术，有可能用于临床肿瘤治疗。

关键词：增强型绿色荧光蛋白 , B细胞白血病-2 , RNA干扰。

THE INHIBITING OF shRNA ON BCL-2 EXPRESSION IN HEPG-2 CELL

Objective: to observe the inhibition of shRNA targeting bcl-2 gene on the expression of bcl-2 in HepG-2 cells. Methods: The DNA sequence targeting bcl-2 gene was cloned into the pGenesil-1, which is the vector expressing shRNA and enhance green fluorescent protein（EGFP） in mammalian cells, the recombinant vector was confirmed with restriction enzyme digestion、PCR and sequencing. The recombinant vectors on inhibiting the genetic transcription and translation of bcl-2 was observed by the RT-PCR; the effects of the recombinant vectors inducing apoptosis and inhibiting generation for the HepG-2 cell expressing bcl-2 was observed. Results: The recombinant vectors were constructed successfully. Only one of the three recombinant vectors could inhibit the HepG-2 expression of bcl-2（inhibition ratio of mRNA was 49.1%；induce the HepG-2 apoptosis ratio was 65.1% and inhibit HepG-2 generation ratio was 46.4%）。 So it is feasible to use RNAi to inhibit the replication of tumor cell and may be effective for the cancer therapy.

Key words: EGFP, bcl-2, RNAi.

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率呈上升趋势。如何有效治疗和控制肿瘤一直是医学领域、乃至生命科学领域急待解决的重大难题[1]。bcl-2是一种细胞凋亡抑制基因，研究结果提示bcl-2可能是一种能通过阻断细胞凋亡作用而致肿瘤发生的重要分子，并且在肿瘤对化疗药物的反应性与抗药性中，bcl-2及其相关基因起着重要的调控作用。据此设想特异性封闭和阻断肿瘤细胞的bcl-2基因表达，有可能抑制肿瘤细胞增殖。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是广泛存在于动植物中的一种基因沉默方式。小干扰RNA（short/small interference RNA，siRNA）有可能成为具有广泛应用前景的抗肿瘤的基因治疗方法。这一可与人类基因组计划（human genomics program，HGP）相提并论的突破性研究进展开创了人类肿瘤基因治疗的新天地，为肿瘤治疗提供了新线索、新思路和新方法[2]。以pGenesil-1载体为骨架，构建了带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的、靶向bcl-2的shRNA表达载体；以高表达bcl-2的HepG-2细胞为靶细胞，探索了shRNA表达载体抑制细胞bcl-2表达、诱导细胞凋亡和生长抑制的作用，为利用RNAi技术治疗临床肿瘤提供了理论基础和实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

携带EGFP基因的pGenesil-1（武汉晶赛生物技术公司）、质粒提取试剂盒（上海华舜生物有限公司），限制性内切酶（MBI公司）、转染试剂lipofectamine2000（invitrogen）、细胞凋亡检测试剂盒（BioVision,Inc）等。

1.2靶向bcl-2基因寡核苷酸的设计

根据shRNA设计原则和GenBank中的bcl-2编码序列选择设计的三对靶向bcl-2基因的DNA序列（分别命名为B1～B3）和一对与任何人类基因序列均无同源性的DNA序列作为阴性对照序列（命名为S），在其两端添加BglⅡ和HindⅢ酶切位点，用TTTTT作为转录终止子，并用BLAST软件进行同源性分析。siRNA序列如下：

B1正义链：5′GATCTGCTGCACCTGACGCCCTTCTTCAAGAGAGAAGGGCGTCAGGTGCAGCTTTTT3′；B2正义链：5′GATCTGAAGTACATCCATTATAAGTTCAAGAGACTTATAATGGATGTACTTCTTTTT3′；B3正义链3′GATCTGGGAGATAGTGATGAAGTATTCAAGAGATACTTCATCACTATCTCCCTTTTT3′；S正义链： 5′GATCTCCTTAGAGTCTCCTGAGCTTCAAGAGAGCTCAGGAGACTCTAAGGCTTTTT3′。

1.3shRNA表达载体的构建

将已复性的DNA序列分别插入pGenesil-1质粒中，制备重组质粒。酶切鉴定重组质粒，最后将经酶切和电泳分析确认的阳性重组质粒送上海基康生物工程有限公司进行DNA序列测定。经上述方法鉴定确认的三个阳性重组质粒被命名为pGenesil-B1～B3; 阴性对照重组质粒命名为shRNA-S。

1.4shRNA表达载体转染HepG-2细胞

HepG-2细胞培养于RPMI1640完全培养液中，置37℃ 、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况。选用对数生长期细胞接种于6孔培养板中（5×105/孔）。按Lipofectasece 2000转染试剂盒的说明转染细胞，转染24h和48h后观察绿色荧光表达情况。

1.5bcl-2 mRNA半定量分析RT-PCR

遵循PCR引物设计原则，根据人bcl-2基因和β-actin cDNA序列，设计并由上海生物工程公司合成上述两基因的引物，其序列为：bcl-2基因引物：b1：5′TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG3′b2：5′TCACTTGTGGCTCAGATAGG3′；内参？-actin的引物为：P1:5′GGGTCAGAAGGATTCCTATG3′P2：5′GGTCTCAAACATGATCTGGG3′。取HepG-2细胞接种于6孔培养板中，分为6组进行实验：pGenesil-B1组， pGenesil-B2组， pGenesil-B3组，阴性对照shRNA-S组、空载体组和空白组，每组设3个平行孔，转染各组细胞，48h后收集细胞按TRIZOL试剂盒的说明提取上诉各组细胞的总RNA；逆转录cDNA后用bcl-2引物和β-actin引物进行分管PCR扩增。取PCR产物电泳后采用BIO-RAD的Qantity One软件进行图象扫描分析，以bcl-2与β-actin的灰度比值A作为比较指标，抑制率=（ A对照组-A实验组）/ A对照组ⅹ100%。

1.6免疫细胞化学法检测bc1-2蛋白

HepG-2细胞接种于96孔板（4.0×104 /孔），如上分6组进行实验，各组细胞转染重组质粒后继续培养48h，根据免疫细胞化学检测试剂盒说明检测bcl-2蛋白含量。

1.7细胞增殖测定（MTT）

按上述方法接种96孔板，转染后分别培养24、48、72、和96h加入MTT100?g，继续培养4 h，弃上清，每孔加入200?l二甲亚砜（DM-SO），用酶标仪检测吸光度OD值，按以下公式计算：

抑制率=（空白对照组均值一实验组均值）/空白对照组均值×100％

1.8流式细胞仪（FACS）检测细胞凋亡

按上述方法接种6孔板，转染后培养48h收集各组细胞，应用细胞凋亡检测试剂盒说明处理细胞后每组取1×106个细胞上流式细胞仪进行检测。实验数据用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。

2结果

2.1重组质粒酶切及DNA测序鉴定

重组质粒和对照pGenesil-S经测序，均与设计合成的反向链完全一致，经BglⅡ酶切后重组质粒与空载体比较无变化；经HindⅢ酶切后均被切开（图1），说明已成功合成重组质粒。

Fig1 pGenesil-B digsted with restriction enzymes

Lane1: DNA maker；Lane2: pGenesil-B1；

Lane3: pGenesil-B digsted with BglⅡ；

Lane4: pGenesil-B digsted with HindⅢ；

Lane5: pGenesil-B digsted with BamHⅠ；

Lane6: pGenesil-B digsted with BamHⅠ/BglⅡ；

lane7: pGenesil-B digsted with HindⅢ/BglⅡ；

lane8: pGenesil-B digsted with HindⅢ/ BamHⅠ

2.2重组质粒在HepG-2细胞中的转染效率

转染24和48 h后在倒置荧光显微镜下观察HepG-2细胞，可见重组质粒和空载体组均有较多细胞表达绿色荧光，未转染组细胞未见绿色荧光（结果未显示）。流式细胞仪检测发现pGenesil-B和对照shRNA-S、空载体组EGFP阳性细胞百分率分别为58.2％、52.6％和56.6％ ，转染组间差异均无统计学意义P>0.05。

2.3RT-PCR检测各组细胞中bcl-2 mRNA转录情况

结果显示除pGenesil-B2对bcl-2 mRNA转录有较强抑制作用外，其它靶向bcl-2的shRNA均未呈现明显的抑制作用（见表1）

表1转染重组质粒后的hepG-2细胞内bcl-2 mRNA的抑制率（%）

Table1 the inhibition ratio on bcl-2 mRNA of the HepG-2 cell transfected and untransfected pGenesil-B（%）

contrastpGenesil-1pGenesil-B1pGenesil-B2pGenesil-B3shRNA-S

A值2.32.32.11.22.22.3

抑制率03-8.3-49.1-4.81.8

2.4重组质粒对HepG-2细胞bcl-2蛋白表达的影响

bcl-2蛋白分布于细胞质，以棕黄色颗粒超过1／4记为阳性细胞，统计500个HepG-2细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。单因素方差分析显示，pGenesil-B分别作用于HepG-2细胞bcl-2蛋白表达量与阴性对照组、未处理组相比差异有统计学意义P<0.05，且pGenesil-B2比其它两种抑制bcl-2蛋白表达更为明显。阴性对照作用于HepG-2细胞bcl-2蛋白表达量与未处理组相比差异无统计学意义P>0.05。

2.5转染重组质粒对HepG-2细胞生长的影响

2.5.1 MTT法检测：

pGenesil-B作用于HepG-2细胞48、72和96 h，明显抑制细胞的生长，分别与阴性对照组、空载体组和未处理组相比，差异有统计学意义P<O.01，pGenesil-B2效果更为显著（表2）。

表2HepG-2细胞转染重组质粒后的细胞抑制率（%）

Table 2 generating inhibition ratio on HepG-2 transfected and untransfected pGenesil-B（%）

空白对照pGenesil-1pGenesil-B1pGenesil-B2pGenesil-B3shRNA-S

A值 抑制率0.8±0.6 00.8±0.03 -4.60.8±0.01 3.80.4±0.02 46.40.7±0.15 8.30.8±0.11 -0.1

2.5.1 流式细胞仪检测： HepG-2细胞转染pGenesil-B2后大量细胞凋亡，而转染pGenesil-B1、B3后，与对照相比变化不大（见表3）。

表3流式细胞仪检测转染重组质粒后HepG-2细胞调亡率（％）

Table3 Apoptosised rate of the HepG-2 cell transfected and untransfected pGenesil-B（％）

凋亡率死亡率凋亡率＋死亡率活细胞率

空白对照 pGenesil-1 pGenesil-B1 pGenesil-B2 pGenesil-B324.2 30.1 37.2 65.1 38.60.5 0.5 0.2 0.5 0.39.3 18.2 31.6 25.2 19.266.1 51.2 30.9 9.5 41.9

3讨论

大量研究表明细胞凋亡调控基因异常、特别是凋亡抑制基因过度表达致细胞存活时间延长和永生化，可能是肿瘤发生发展的首要而关键的步骤。肿瘤细胞所表现的这些特征不仅限制了肿瘤常规治疗方法的疗效，而且提示抗细胞凋亡基因有可能成为临床肿瘤治疗的重要靶分子[3]。以细胞凋亡抑制基因bcl-2为靶基因、高表达bcl-2蛋白的HepG-2细胞为靶细胞，采用RNAi技术探索了shRNA表达载体抑制bcl-2蛋白表达，诱导HepG-2细胞凋亡和抑制该细胞增殖的作用，从所获研究结果中得到以下启示。

具强大细胞凋亡抑制作用的bcl-2蛋白在恶性黑色素瘤、肝癌，乳腺癌等许多肿瘤中都有过度表达；且bcl-2 表达越高，其恶性程度亦越高，越容易产生耐药性，相应的临床疗效也越差。研究结果证实pGenesil-B2不仅可使HepG-2细胞的bcl-2转录水平减少、 bcl-2蛋白表达下调，而且可致65.1%细胞凋亡、细胞增殖量也减少46.4%。同时还可增加该细胞对化疗药物的敏感性（待发表资料）。研究结果提示，bcl-2无疑将成为发展靶向性药物的重要分子，因此靶向抑制肿瘤细胞内的bcl-2抗凋亡蛋白产生，有可能成为抗肿瘤治疗的新方法。

本研究为抑制bcl-2复制的实验与应用研究提供了理论与实验依据，为进一步进行有关研究提供了一定的物质基础，而且还将为抑制其它癌基因复制的研究提供可借鉴的技术路线、实验方法和物质基础，具较大的理论意义，实用价值。因此对RNAi的深入研究，无疑将大大推进基因功能的研究，而且将有可能为各种肿瘤、自身免疫性疾病和其它遗传异常相关疾病的根治开辟新的途径。RNAi的研究与应用，具有极其重要的理论和实际意义可以预见在此领域的研究成果将对生物学和医学的发展产生深远的影响[4]。

参考文献

[1]Taieb J, Barbare JC, Boussaha T, et al. [Management of hepatocellular carcinoma. Where are we now? What's next?][J]. Bull Cancer.2009,96（1）：19-34.

[2]MacKeigan JP，Murphy LO，Blenis J.Sensitized RNAi screen of human kinases and phosphatases identifies new regulators of apoptosis and chemoresistance[J].Nat Cell Biol,2005，7（6）：591-600.

[3]Sawyers C. Targeted cancer therapy[J]. Nature,2004,432（7015）：294-297.

[4]Aigner A. Cellular delivery in vivo of siRNA-based therapeutics[J]. Curr Pharm Des,2008,14（34）：3603-3619.